Особый период в жизни монастыря связан с именем святителя Димитрия Ростовского. Святитель Димитрий, нареченный в Святом Крещении Даниилом, родился 11 декабря 1651 года в селе Макарове близ Киева, в семье Саввы Григорьевича Туптало († 1703), казака, дослужившегося до полкового сотника, затем принявшего иноческий постриг в Киевском Кирилловском монастыре и умершего 103 лет от роду. Мать Даниила, Мария Михайловна, умерла в 1689 году. В 1660 году сотник Савва с семьей переселился в Киев, где купил дом на Подоле. Учиться грамоте Даниил начал дома, а с 1662 года продолжил учебу в Киево-Могилянской коллегии. Ректором ее в то время был Иоанникий Галятовский, известный писатель и проповедник. Преподаватели Коллегии стремились сделать из своих учеников искусных борцов с пропагандистами унии и католичества. Большое внимание придавалось знанию латинского языка как литературного языка всей Западной Европы. Изучение рукописей святителя показало, что он свободно владел латинским языком, а также польским, знал он и греческий язык. На восемнадцатом году жизни, 9 июля 1668 года, в Киевском Кирилловском монастыре Даниил принял иноческий постриг с именем Димитрий — в честь великомученика Димитрия Солунского. Келейная молитва, строгий пост, неопустительное посещение храма Божия, чтение душеполезных книг были ежедневными занятиями Димитрия, которыми очищалась и просвещалась душа его. В Кирилловском монастыре он начал свое знакомство с латинской, южнославянской церковной и исторической литературой, знание которой скажется позднее в его писательских трудах. В 1669 году, 25 марта, в Каневе Димитрий был посвящен в иеродиакона, а в 1675 году, 23 мая, архиепископом Лазарем (Барановичем) рукоположен в иеромонаха. В 23 года он стал известным проповедником. Его проповеди со вниманием слушали в Чернигове, Вильне, Батурине, Слуцке. Иеромонах Димитрий весь свой дар красноречия направил на защиту Православия, против насилия униатов.

В 1680-е годы архимандрит Киево-Печерской Лавры Варлаам (Ясинский), проповедник обители, заведовавший типографским делом, задумал издание полных Четьих-Миней. В 1680 году в Москве он ходатайствовал перед Патриархом Иоакимом о выдаче ему Великих Макарьевских Четьих-Миней для составления новых. 6 мая 1684 года в Киево-Печерской Лавре состоялся собор лаврских старцев и братии под председательством архимандрита Варлаама. Собор благословил Димитрия на особое послушание — составление житий святых. Первая книга Житий, отпечатанная в типографии Киево-Печерской Лавры, вышла в 1688 году. Она охватывала сентябрь — ноябрь. Затем, в 1695 году, напечатана была вторая книга житий (декабрь, январь, февраль), а в 1700 году — третья книга (март, апрель, май). Святитель Димитрий весь ушел в многосложный материал, жил все эти годы постижением духовных подвигов Божиим угодников и молитвами. Свой труд святитель Димитрий закончил уже в Ростове, куда царь Петр I назначил его митрополитом.

1 марта 1702 года, в воскресенье второй седмицы Великого поста, святитель Димитрий прибыл в Ростов. Народ встречал его на окраине города в Иаковлевском монастыре, одном из ближайших к Московской заставе. В Зачатьевском соборе святитель Димитрий отслужил благодарственный молебен и, выходя из храма, пророчески указал место своего погребения в юго-западном углу церкви, сказав: Се покой мой, зде вселюся в век века. Многолетний изнуряющий труд сильно подорвал здоровье святителя Димитрия, но, несмотря на болезни, он полностью отдавался архипастырскому служению. В любую погоду — ненастье, жару, мороз — владыка ездил по храмам обширной митрополии. С горячими проповедями выступал он против раскола, который мешал духовному единению русских людей. При Архиерейском доме святитель Димитрий открыл Духовную школу, где обучалось около 200 детей разных сословий. Такое учебное заведение было вторым в России после Московского. Школа делилась на три класса: низший (грамматический), средний (латинский), высший (философский). В грамматическом классе дети проходили полный курс грамматики за три года. Кроме того, в школе изучали латинский и древнегреческий языки, нотное пение, стихосложение, риторику. Это училище было любимой заботой святителя, и на содержание его он отдавал все свои средства. Святитель Димитрий часто навещал эту школу, читал и толковал детям Священное Писание, наставлял их с большим вниманием и заботой.

Ростовская школа святителя Димитрия положила начало открытию школ при архиерейских домах во всех российских епархиях. По праздникам и в дни именин учителей ученики произносили речи в стихах, ими написанные. Сам святитель Димитрий в первый год пребывания в Ростове написал для школы Рождественскую драму, поставленную 24 декабря 1702 года. Драмы он писал еще в бытность свою на Украине и позднее — в Ростове. Много внимания владыка уделял пастырям, на которых он возложил обучение прихожан молитвам.

Святителя любили, часто после службы прихожане окружали его, прося разрешить их недоумения. Уважали его и за многолетний подвижнический книжный труд, за скромный образ жизни.

Кроме Житий святых святитель Димитрий оставил после себя многочисленные богословские труды, в которых он толкует догматы Православной Церкви, обличает заблуждения раскола и сект, является церковным историком. Писал святитель Димитрий также и духовные стихи, драматические произведения. Свой литературный талант, свои многосторонние познания принес святитель Димитрий в дар Православной Церкви, Его произведения получили широкое Распространение не только в России, но и в Болгарии, Сербии, Румынии.

Семь лет, восемь месяцев и двадцать шесть дней подвизался святитель Димитрий на Ростовской кафедре. 28 октября 1709 года последовала блаженная кончина святителя. Тело святителя было облачено в архиерейские одежды, заранее им самим приготовленные. В гроб, под голову и тело, по его желанию были положены черновики его трудов. Гроб был поставлен в домовый храм ростовских архиереев — церковь Спаса Всемилостивого (Спаса на Сенях). В тот день по пути в Толгу в Ростов прибыла царица Параскева Феодоровна с царевнами Екатериной, Параскевой и Анной Иоанновнами. В их присутствии совершена была первая соборная панихида. 30 октября по желанию царицы гроб с телом святителя Димитрия был перенесен в Успенский собор и здесь была совершена вторая панихида. Около месяца тело святителя Димитрия находилось в Успенском соборе в ожидании прибытия Местоблюстителя Патриаршего престола митрополита Рязанского Стефана (Яворского), друга почившего. Святителя Димитрия погребли согласно его завещанию в соборе Зачатьевской обители 25 ноября. На месте погребения была воздвигнута деревянная гробница со стихами-эпитафией, написанная митрополитом Стефаном. Кроме библиотеки, после святителя Димитрия ничего не осталось.

Обретение мощей святителя Димитрия произошло 42 года спустя после его кончины. 21 сентября 1752 года при починке церковного пола обнаружен был гроб. Крышка гроба от обрушившихся сверху бревен оказалась разбитой и сквозь разлом были видны митра и святительские одежды, не тронутые тлением. Мощи святителя Димитрия трижды освидетельствовали церковные иерархи. В то время под влиянием Запада и раскольников в обществе бытовало мнение о невозможности новых явлений святости. И вот, обретены мощи первого святого в Синодальный период истории Русской Православной Церкви. Народ, услышав об обретении святых мощей, толпами спешил к новоявленному святому, и при гробе его многие получали исцеление. Митрополит Арсений (Мацеевич) дал распоряжение эконому Иаковлевского монастыря завести особую тетрадь, куда исцеленные могли бы сами записывать свои рассказы о помощи угодника Божия по их молитвам. Большая рукописная книга, куда занесены чудеса за время с 1753 по 1764 г.; хранится в архиве Ростовского музея. Описано 288 исцелений. Некоторые из них были обнародованы позднее в книге «Слава святителя и чудотворца Димитрия, митрополита Ростовского».

В 1757 году состоялось прославление святителя Димитрия, митрополита Ростовского. Тогда же было установлено праздновать ему в день обретения мощей 21 сентября и 28 октября — в день преставления. По поручению Святейшего Синода святитель Арсений, митрополит Ростовский, тогда же написал Житие святого Димитрия, а епископ Переславский Амвросий (Каменский) составил службу.

В 1758 году усердием Императрицы Елизаветы Петровны из первого серебра, добытого в ее царствование на Колыванских рудниках, была устроена для мощей святителя рака, в которую они с благоговением и были переложены.